抗菌抑菌实验定义概念

用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效能的实验称爲抑菌实验。经过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌功能，这是抗菌药物的最根本的药效学数据。次要办法有停止定性测定的分散法（如抑菌斑实验）和停止定量测定的浓缩法（如最低抑菌浓度实验）。

目录

常用办法、常量肉汤浓缩法、微量肉汤浓缩法、琼脂浓缩法、纸片分散法、E实验

常用办法

常量肉汤浓缩法

抗菌药物储存液制备：抗菌药物储存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物间接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式停止计算。例如：需配制100 ml浓度爲1280μg/ml的抗生素储存液，所用抗生素爲粉剂，其药物的无效力爲750μg/mg。用剖析天平准确称取抗生素粉剂的量爲182.6 mg。依据公式计算所需浓缩剂用量爲：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml浓缩剂中。制备抗菌药物储存液所用的溶剂和浓缩剂见表5。配制好的抗菌药物储存液应储存于-60℃以下环境，保管期不超越6个月。

药敏实验用抗菌药物浓度范围 依据NCCLS抗菌药物敏理性实验操作规范，药物浓度范围应包括耐药、中介和敏感分界点值，特殊状况例外。

培育基：NCCLS引荐运用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培育基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏理性时，应在肉汤中参加2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需求量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌运用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌运用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。

接种物的制备：有2种办法配制接种物，一是细菌生长办法，用接种环挑取形状类似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生临时菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊规范，约含1~2×108CFU/ml。二是间接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，引荐间接取培育18~24h的菌落分配成0.5麦氏比浊规范的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液停止1∶100浓缩后备用。留意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培育，以反省接种物纯度。

注：在临床微生物学检验中，麦氏比浊法常用于细菌鉴定、药敏实验前配置菌液时大致判别菌液浓度的一种办法，通常以为，如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，相当于1.5×108细菌数/ml，由于办法自身就是一种估量的办法，所以虽然不同细菌大小差别很大，除了真菌孢子，细菌的差异不大，后果不会有影响。但是，规范比浊管的浓度，是药敏实验后果的影响要素之一。

附：0.5麦氏比浊管配制办法

0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml

0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml

将二液混合，置螺笔试管中，放室温暗处保管。用前混匀。

无效期爲6个月。

浓缩抗菌药物的制备及菌液接种

浓缩抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管参加1.6mlMH肉汤外，其他每管参加MH肉汤1ml，在第1管参加抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后汲取1ml至第2管，混匀后再汲取1ml至第3管，如此延续倍比浓缩至第11管，并从第11管中汲取1ml弃去，第12管爲不含药物的生长对照。此时各管药物浓度顺次爲256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内参加上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约爲5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度辨别爲128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。

孵育：将接种好的浓缩管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对能够的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应继续孵育满24h。

结果判别与解释：在读取和报告所测试菌株的MIC前，应反省生长对看管的细菌生长状况能否良好，同时还应反省接种物的传代培育状况以确定其能否净化，质控菌株的MIC值能否处于质控范围。以肉眼察看，药物最低浓度管无细菌生长者，即爲受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤浓缩法起点判别，与阳性生长对看管比拟抑制80%细菌生长管药物浓度爲受试菌MIC。

依据NCCLS引荐的分界点值规范，判别耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被测菌株所惹起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量医治无效，忌讳症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所到达的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如β-内酰胺酶），所以临床医治效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以经过进步剂量（如β-内酰胺类药物）被抑制，或在药物生感性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还作爲“缓冲域”，以避免由巨大的技术要素失控，所招致较大的错曲解释。

微量肉汤浓缩法

抗菌药物和培育基制备 同常量肉汤浓缩法。

MIC板制备

板制备 无菌操作，将倍比浓缩后不同浓度的抗菌药物溶液辨别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作爲生长对照，冰冻枯燥后密封，-20℃以下保管备用。

接种物制备：将用生长法或间接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊规范的菌悬液，经MH肉汤1∶1000浓缩后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判别后果。当实验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵育工夫爲20~24h，实验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏实验时孵育工夫必需满24h。此时，第1孔至第11孔药物浓度辨别爲128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。

结果判别：以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度爲MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌分明生长实验才有意义。当在微量肉汤浓缩法呈现单一的跳孔时，应记载抑制细菌生长的最高药物浓度。如呈现多处跳孔，则不应报告后果，需反复实验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤浓缩法测得的MIC与常量肉汤浓缩法测得的后果相反或低一个浓缩度（1孔或2倍）。

琼脂浓缩法

引见

琼脂浓缩法是将不同剂量的抗菌药物，参加消融并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递加浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后察看细菌生长状况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度爲MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，后果牢靠，易发现净化菌；缺陷是制备含药琼脂平板费时费力。

培育基制备：运用MH琼脂，按商品阐明书停止配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌运用GC琼脂根底加1%添加剂；其它链球菌运用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当实验磺胺药时，运用溶解的马血）。

含药琼脂平板制备：依据实验设计，将已倍比浓缩的不同浓度的抗菌药物辨别参加已加热溶解，并在45~50℃水浴中均衡的MH琼脂中，充沛混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，依据需求来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可储存5天。

接种物制备与接种：制备浓度相当于0.5麦氏规范比浊管的菌悬液，再1∶10浓缩，以多点接种器汲取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板外表，每点菌数约爲104CFU，构成直径爲5~8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育工夫应满24h），察看后果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。

结果判别：将平板置于暗色、无反光物体外表上判别实验起点，以抑制细菌生长的最低药物浓度爲MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见细微细菌生长，与生长对照比拟抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作爲起点浓度。

假如呈现有2个以上菌落生善于含药浓度高于起点程度的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长景象，则应反省培育物纯度或反复实验。

纸片分散法

纸片分散法(K-B法)又称琼脂分散法

K-B法药敏实验时接种物配制有两种办法。

第一种是肉汤增菌法（对数生长法），是用接环挑取3-5个细菌菌落入肉汤增菌管中停止增菌4-6小时，然后用生理盐水或肉汤对增菌管中的培育物停止浓缩校正使其浓度到达0.5麦氏比浊规范（由于经过增菌培育其培育物浓度普通都高于此规范）。

第二种办法是间接菌落法：从孵育18-24小时的非选择性培育基上，挑取3-5菌落，间接用肉汤或盐制成悬液作爲接种，然后将浊度调整至0.5麦氏比浊规范。此法是检测苛养菌（如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌）和潜在的对甲氧西林耐药的葡萄球菌的引荐办法。

将菌制成菌悬液用无菌棉签蘸取菌液在管壁上挤去多余菌液 ,涂布整个M2H平板外表 ,重复 3 次 ,每次将平板旋转60 度 ,保证涂布平均 ,35 ℃培育后菌落呈半交融形态 ,否则影响药敏后果。

K-B 法指定用 M-H琼脂平板 ,使用直径90cm平皿 ,在程度的无菌台上倾倒 ,精确量取高压灭菌后的M2H琼脂液25ml ,使之琼脂板厚度爲 4mm。否则厚渡过高 ,使含药物纸片的药物半球形分散的体积加大 ,招致假耐药;反之招致假敏感。

要求纸片直径 6.00～6.35mm每片吸水量约012 μl ,纸片的药物含量必需与 K 2B 法规则的

分歧 ,用前必需做质量鉴定 ,质量合格方可运用。纸片的保管尤爲重要 ,普通要求保管在有枯燥剂的容器内高温保管 ,纸片取出后须放室温10min前方可翻开 ,否则空气中的水份冷凝在纸片上易潮解 ,使药物生效影响药敏实验后果。

E实验

E实验是指浓度梯度琼脂分散实验，其原理根本同分散法，即浓度呈延续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中分散，在试条四周抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而构成通明的抑菌圈。E实验综合了浓缩法和分散法的原理和特点，同时还补偿了二者的一些缺乏，可以像浓缩法一样间接定量测出抗菌药物对受试菌的MIC。

培育基、菌液制备和接种

培育基、菌液制备和接种 同纸片分散法。

贴E实验条：同纸片分散法，E实验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦接触琼脂后不得再挪动。直径150mm的平皿内可放置6根E实验试条，90mm者普通只能放置1根。

孵育工夫和温度：同纸片分散法。

结果阅读：孵育后围绕试条可构成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅读时应留意的成绩见供给商的商品阐明书。